Es conveniente, al tratar este tema, dar una definición clara del
término y de otros relacionados, ya que a veces suelen producirse confusiones.
- Esterilización significa la eliminación de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios físicos, por ejemplo, filtración, o por muerte de los organismos por calor, productos químicos u otra vía. Esta definición excluye por lo tanto cualquier técnica que resulte solamente en un daño a los microorganismos o atenuación de la actividad de cualquier tipo.
- La
palabra desinfección se aplica a la remoción o destrucción por
cualquier vía de organismos vivos que pueden causar daño particular o
infección. No significa por lo tanto la destrucción de todos los microorganismos,
sino solamente de aquellos que pueden producir un resultado no deseado.
- Un antiséptico es un desinfectante, o sea un agente químico usado para destruir microorganismos dañinos. Se utiliza en general para agentes a ser aplicados en animales o humanos.
- Asepsia
es
la exclusión continuada de microorganismos contaminantes. Así por ejemplo
el cultivo de microorganismos en el laboratorio es llevado a cabo
asépticamente como en muchas fermentaciones industriales. El medio de
cultivo es esterilizado para remover toda forma de vida y luego inoculado
con el cultivo requerido. Se dice entonces que el sistema se mantiene en
condiciones asépticas.
- Pasteurización
es
el término aplicado al proceso que se utiliza para la destrucciónde
algunos de los microorganismos posiblemente presentes en materiales
sensibles al calor como la leche y cerveza. Consiste en calentar la leche,
por ejemplo a 62 °C, mantenerla a esta temperatura 30 minutos y después
enfriarla lo más rápidamente posible. Esta técnica no es de ninguna manera
un procedimiento de esterilización. Es solamente un método para destruir
organismos patógenosy al mismo tiempo disminuir el nivel de aquellos
organismos que más pueden deteriorar la leche.
La razón fundamental para efectuar la esterilización en Microbiología
Industrial es para evitar la competición por los nutrientes en medios de
cultivo y permitir así que el cultivo de microorganismos específicos que se
utilizan en un proceso de fermentación de los rendimientos esperados en biomasa
y/o metabolitos específicos.
Los métodos de esterilización pueden ser de 3 tipos:
- Por
destrucción total de microorganismos.
- Por
muerte o
- Por
eliminación con medios físicos.
Por destrucción total se entiende un proceso muy violento, que casi
siempre implica calentamiento apreciable del material, como ocurre con la
aplicación de una llama, que es lo que hacemos en el laboratorio cuando
flameamos un ansa de platino o las bocas de tubo de ensayo o erlenmeyers. Otra
manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes.
Por supuesto ésta metodología, aunque es efectiva, está muy restringida en su
empleo.
La muerte o inactivación significa la eliminación de microorganismos
sin que exista necesariamente desintegración de las células. Se puede efectuar
por calentamiento, seco o húmedo, por radiaciones o por agentes químicos. El
calor húmedo, generalmente en forma de vapor bajo presión, es muy útil y de
gran valor en la esterilización en el laboratorio, que se efectúa en autoclave,
o en la industria cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de
fermentación. En el caso de los autoclaves, se pueden alcanzar presiones de 1 a
3 atmósferas. En escala grande el equipo de producción es esterilizado con vapor
saturado bajo presión, y la presión requerida debe ser alcanzada en todas las
partes del equipo y el aire debe ser purgado totalmente del sistema (como
ocurre también en el caso de los autoclaves) porque la transferencia de calor
disminuye mucho en ese caso. Después de la esterilización se mantienen las
condiciones asépticas, haciendo pasar vapor por las válvulas y sellos.
La eliminación física está restringida a la esterilización de gases
líquidos, y es fundamentalmente llevada a cabo por filtración mediante filtros
absolutos o filtros fibrosos.
Los filtros absolutos son de materiales cerámicos, de vidrio o de
metal sinterizado con poros tan pequeños que la penetración de los
microorganismos no es posible.
Los filtros fibrosos no son absolutos y el material filtrante puede
ser lana de vidrio, amianto y esteres de celulosa, siendo las fibras de un
diámetro variable de 0.5 a 15 micrones.
La cinética de la esterilización por calor húmedo, que es la única que
consideraremos en ésta monografía por su aplicación a la esterilización de
medios de fermentación, está caracterizada bastante aproximadamente por una
reacción cinética de primer orden.
Si No es el número de organismos viables presentes
inicialmente y N es número viable al final tendremos que la ecuación de
velocidad de muerte será:
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 es la fracción de organismos
viables que sobreviven después del tratamiento por calor durante el tiempo t
y K = constante de velocidad de destrucción, que depende de la temperatura
según la clásica ecuación de Arrhenius: |
 |
donde
A = constante
E = energía de activación
R = Constante general de los gases
T = Temperatura en grados Kelvin
Si se gráfica el In k en función de 1/T se obtendrá una línea recta,
siendo la inclinación igual a -E/R y la intersección de la recta con la
ordenada, el valor de la constante de Arrtherius.
La ecuación de velocidad de muerte necesita una aclaración, ya que la
misma no admite una disminución del número de organismos a cero, porque si N es
cero, t debería ser infinito. Para resolver este problema supongamos que N =
0.1 y calculemos el valor correspondiente de t. No podemos decir que después de
ese tiempo sobrevivirá una décima parte de un microorganismo, pero si podemos
decir que habrá sólo una probabilidad de 1 en 10 de que sobreviva un
microorganismo. Ya veremos que por razones de seguridad podemos fijar el valor
de N = 0.001 o sea fijar una probabilidad de 1 en 1000 de sobrevivencia.
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La figura muestra una curva típica de la esterilización en
"batch" de un medio en un fermentador. La curva AB represen ta la
etapa de calentamiento, la parte BC corresponde a la etapa de
mantenimiento y CD es la etapa de enfriamiento. Durante la primera y última
etapa ocurre parte de la destrucción térmica de organismos presentes en el
medio debido a que se alcanza temperatura elevada sobre todo en la última parte
de la curva AB y la primera parte de la curva CD. Se considera que la
temperatura a partir de la cual se produce destrucción de esporos es 100 °C.
Por lo tanto tendremos eliminación de esporos de 100 a 120 °C durante la etapa
de calentamiento y de 120 a 100 °C durante la correspondienteal
enfriamiento. Los tiempos de calentamiento y enfriamiento varían de acuerdo al
volumen del equipo. En fermentadores industriales de 60.000 1 por ejemplo esos
tiempos están en el orden de 28-30 min. y 11-14 min. para los períodos de
calentamiento y enfriamiento respectivamente.
En la práctica de la esterilización es necesario tener presente que la
calidad nutriente del medio debe ser preservada todo lo posible, razón por la
cual, es imprescindiblediseñar un ciclo de esterilización lo más efectivo
posible pero al mismo tiempo lo más corto posible.
Podremos definir un término (V) que representa la magnitud de la
disminución del número de organismos viables de manera que:
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para el período de calentamiento y de enfriamiento con el fin de
calcular la cantidad de esporos que se eliminan durante ambos períodos.
Conociendo el valor inicial de esporos presentes en el volumen de medio
considerado es posible calcular el tiempo de mantenimiento a 120 °C para la
esterilización completa del mismo.
Existen datos, en bibliografía, de cálculo de tiempo de mantenimiento
para la esterilización de 45.000 l de medio (con un valor de No = 2
x 107 esp/ml) que demuestra que son necesarios solamente 8.8 min
como tiempo de mantenimiento a 120 °C.
Debe tenerse en cuenta que estas consideraciones son válidas para el
cálculo del tiempo de esterilización mínimo, a 120 °C, en fermentadores
industriales del volumen considerado. En el caso del laboratorio cuando
utilizamos un autoclave y deseamos esterilizar distintos recipientes con volúmenes
diversos de medio, el tiempo de calentamiento y de enfriamiento no son
generalmente considerados, salvo en el caso de equipos que tengan un período de
calentamiento y de enfriamiento prolongado, los que por otra parte no son
recomendados para su uso en el laboratorio. Lo que es importante en este caso
es el tipo de recipiente, su geometría y el volumen de medio a esterilizar.
El tiempo de esterilización (o sea el tiempo de mantenimiento a 120
°C) requerido por ejemplo para tubos de ensayo de 18 x 50 mm es de 12-14 min y
para tubos de 38 x 200 mm, de 15-20 min. Erlenmeyers de 2000 ml requieren de
30-35 min mientras que si son de 125 ml el tiempo es de 12-14 min. En cambio un
frasco pyrex cuadrado de 1000 ml requiere 30-35 min y una botella de suero de 9000
ml 50-55 min. Estos tiempos aseguran la eliminación de esporos bacterianos de
las especies más resistentes.
Como ya dijimos anteriormente, los medios de fermentación utilizados
en la industria son casi siempre complejos y a menudo con sólidos en
suspensión, de manera tal que los cambios que se producen durante la
esterilización pueden ser importantes. A veces puede haber modificaciones
beneficiosas o perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilización.
Existen casos en los cuales si se prolonga la esterilización 50 a 60
min se producen pérdidas de rendimiento que llegan hasta el 65% con respecto al
medio normal. En ciertos casos cuando el tiempo es solamente de 15-20 min se
puede producir un efecto beneficioso.
La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los
componentes de un medio, durante la esterilización por calor, dependerá no
solamente de la naturaleza de los componentes sino también de la temperatura,
duración del calentamiento, pH del medio, y de la agitación. Un ejemplo típico
de interacción es la reacción de Maillard que tiene lugar entre los grupos
carbonilos de los azúcares con los grupos amino de proteínas, aminoácidos, etc.
Se forman así productos de condensación con lo cual se inactivan significativas
cantidades de carbohidratos y nitrógeno amínico. Por ese motivo es necesario
que los carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos
nitrogenados orgánicos.
Las sales de NH4+ se deben autoclavar a pH 7 o menor, si no
el amonio se volatiliza.
En medios químicamente definidos se puede observar pérdida importante
de magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por precipitación de sales poco
solubles como MgNH4PO4 , MgKP04 y MgNaP04.
Es importante por lo tanto autoclavar las sales de calcio y magnesio aparte de
los fosfatos.
Los aminoácidos y factores de crecimiento son muy lábiles al calor.
Entre los aminoácidos, el triptofano, glutamina, asparagina, y entre las
vitaminas hidrosolubles, la tiamina, riboflavina y piridoxina son las más
susceptibles de sufrir descomposición. En todos estos casos es aconsejable
disolverlas separadamente en pequeños volúmenes de H2O y luego
esterilizarlas por filtración.
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Como ya dijimos es fundamental, además de esterilizar correctamente
los medios, conservar al máximo la calidad nutriente de los mismos. En la misma
forma que la inactivación de microorganismos puede ser considerada una reacción
cinética de primer orden, también la destrucción de algunos compuestos
sensibles al calor puede ser tratada en la misma forma.
La energía de activación de tales reacciones está generalmente en el
rango de 10.000-30.000 cal.mol-1 mientras que la correspondiente a
la destrucción térmica de esporos es superior (65.000-85.000 cal.mol-1
). Una representación gráfica daría una línea recta para ambos casos con
valores distintos de pendientes según se aprecia en la Figura
La figura muestra que a medida que la temperatura aumenta, el valor de
k para la reacción con baja E (curva A) aumenta más lentamente que en el otro
caso.
Esto significa que un aumento de la temperatura acelera la destrucción
de esporos más que la degradación de nutrientes. Recordando la ecuación
anterior:
vemos que el tiempo requerido para la destrucción de esporos decrece
en proporción al aumento de k. Por lo tanto si se emplea alta temperatura para
la esterilización se requiere un tiempo menor, por lo cual se concluye que la
esterilización llamada de alta temperatura-corto tiempo favorece la
conservación de la calidad nutriente al mismo tiempo que produce la destrucción
efectiva de los esporos.
Es necesario aclarar que el uso de alta temperatura con tiempos cortos
en escala grande implica necesariamente el empleo de un sistema de
calentamiento y enfriamiento continuo en lugar de proceso de esterilización en
batch.
